На последнем уроке мы поговорили со всеми.Практическая версия методологии разработки ELISA - Разработка количественных методов обнаружения биомолекулА.
В этом выпуске Xiao Ou делится с вами еще одной важной темой: « Практическая версия разработки методологии ELISA - разработка методов определения сродства».

I. Предисловие

В настоящее время методы, используемые для определения сродства между рецепторами, то есть для диссоциации констант равновесия, в основном включают:

1. Термодинамический метод измерения
2. Динамический метод измерения
3. метод концентрации насыщения

Среди них более распространены динамические методы измерения и концентрации насыщения:Динамический метод измерения(Например, Biacore)Это связано с более дорогими инструментами,Метод определения концентрации насыщения широко используется на большинстве отечественных биофармацевтических предприятий.

Измерение сродства, используемое ELISA, является доминирующей моделью для определения концентрации насыщения, часто используемой для оценки активности белковых уровней антигенов или антител и оценки устойчивости антител.
Для определения сродства ELISA часто не имеет коммерческих наборов реагентов и требует методологических разработок со стороны экспериментаторов.

Из - за отсутствия образования в области биотехнологии и недостаточного накопления новых фармацевтических разработок в этой области, методологически проверенный метод измерения близости ELISA является более сложным для многих практиков и может привести к ошибкам, таким как ошибки передачи новых номеров или отклонения.
Одним из таких заблуждений является разработка метода измерения сродства ELISA с использованием количественных экспериментальных условий ELISA.

Эта статья начинается с основ метода определения сродства.Опишите основные принципы измерения сродства методом концентрации насыщения, опишите соотношение дозы антигенных антител при разработке метода ELISA и несколько ошибок, которые могут возникнуть при применении метода ELISA для определения сродства, и ознакомьте вас с общими методами определения сродства и предварительными методологическими разработками.

II. Основные понятия родства

Анализируя несколько случаев химических реакций, мы объясняем, что называется сродством.

例子A
Водород и кислород образуют воду в условиях возгорания.
Когда реакция прекращается, если мольная концентрация водорода в реакционной среде оказывается в два раза выше мольной концентрации кислорода, оба потребляются, и в реакционной среде есть только вода; Если мольная концентрация водорода в два раза превышает мольную концентрацию кислорода, кислород потребляется, и в реакционной среде есть только водород и вода; Когда мольная концентрация фруктового водорода меньше, чем мольная концентрация кислорода в 2 раза, водород потребляется, и в реакционной среде есть только кислород и вода.
Это основа химических реакций, в результате которых реакторы могут превращаться в генераторы, то есть реакции могут идти до конца, и реакции, которые характеризуются процессами и результатами таких реакций, называются необратимыми реакциями.

例子B
Антиген PD1(КД279)Антитела PD1(Как в PEбролизумаб)Реакция при комнатной температуре и постоянном давлении.
При остановке реакции, если мольная концентрация CD279 в реакционной среде составляет 200 нм, а мольная концентрация пембролизумаба - 100 нм, концентрация комплекса пембролизумаб - CD279 в идеальных условиях составляет 97,86 нм, мольная концентрация CD279 - 4,28 нм, а пембролизумаб - 2,14 нм;
Если мольная концентрация CD279 в реакционной среде составляет 100 нм, мольная концентрация пембролизумаба - 200 нм, то концентрация комплекса пембролизумаб - CD279 в идеальных условиях составляет 49,81 нм, мольная концентрация CD279 - 0,38 нм и пембролизумаб - 159,19 нм.

Пример C
Антиген PD1(КД279)Антиген PDL1(CD274)Реакция при комнатной температуре и постоянном давлении.
Если мольная концентрация CD279 в реакционной среде составляет 200 нм, мольная концентрация CD274 - 100 нм, то в идеальных условиях на момент завершения реакции концентрация CD274 - CD279 составляет 2,35 нм, мольная концентрация CD279 - 197,65 нм, а мольная концентрация CD274 - 97,65 нм;
Если мольная концентрация CD279 в реакционной среде составляет 100 нм, мольная концентрация CD274 - 200 нм, то в идеальных условиях на момент завершения реакции концентрация CD274 - CD279 составляет 2,35 нм, мольная концентрация CD279 - 97,65 нм, мольная концентрация CD274 - 197,65 нм, и подавляющее большинство CD279 и CD274 не участвуют в реакции.
Случаи B и C, как антигены, так и антитела(Рецепторы и рецепторы)В сочетании с реакцией, две реакции имеют процесс положительной реакции на образование композита, есть также реакция диссоциации композита на образование антигена, процесс обратной реакции антитела, конечным результатом является состояние сосуществования антигена, антитела и антигена - антителочного комплекса.

Такая реакция называетсяОбратная реакцияА.
Когда скорость положительной и обратной реакции в обратимой реакции равна, концентрация антигенов, антител и антигенно - антителочных комплексов в реакционной системе не увеличивается и не уменьшается, обратная реакция завершается, а мольная концентрация компонентов реакционной системы находится в динамическом равновесии.

Близость(Афинитет)Это характерный параметр относительного состояния антигенов, антител и антигенно - антителочных комплексов во время обратимой реакции, более профессиональное и терминологическое название которой - константа диссоциативного равновесия КД, единица моль / л(Соответствует единицам концентрации)А.

Чем меньше значение сродства, тем сильнее сродство, и сила сродства определяет относительное количество компонентов обратимой реакции при завершении окончательной решающей реакции.

Примеры B и C, как и 200 nM CD279(ПД1)Реакция, антитела Pembrolizumab(Антитела PD1)Отношение к CD279 составляет 0,4 нм, состав CD274(ПДЛ1)По сравнению с CD279 аффинитная сила составляет 8200 нм, в результате конечной реакции образуется комплекс pembrolizumab - CD279, который составляет 97,86 нм, в то время как комплекс CD274 - CD279 имеет только 2,35 нм, что в 42 раза больше разницы.

В отличие от необратимых реакций, кроме молярной концентрации антигенов и антител(Рецепторы и рецепторы)Близость между ними будет влиять * на количество продуктов, образующихся в обратимой реакции.

Знаете ли вы основные принципы разработки методологии ELISA?

Для краткого обзора методов и принципов определения сродства читатель может обратиться к статье оценки близости методов оценки биофункционального скрининга.
В этой статье в основном обобщается метод концентрации насыщения.
РпредставлятьРецепторыилиАнтигенА,ЛпредставлятьСочетаниеилиантителоА.
Используя метод концентрации насыщения, если необходимо определить сродство рецептора по отношению к рецептору, при наличии небольшого количества R, L разбавляется градиентом, чтобы обнаружить концентрацию R - L - комплекса, и L соответствует значению концентрации, когда концентрация R - L - комплекса составляет половину общей концентрации R(ЭК50)Значение KD для L относительно R.
Значение RL / R, т. е. B, может быть заменено обнаруженным значением сигнала, а функциональное соотношение между градиентным разбавлением L и сигналом соответствует следующей формуле, только если значение EC50 может быть эквивалентно значению KD в определенных экспериментальных условиях.
Концентрация насыщения измеряет KD по нескольким ключевым точкам,То есть две взаимодействующие молекулы, R в небольшом количестве, L для непрерывного градиентного разбавления, требуемое значение отклика сигнала(Все точки соединения R заняты L)То есть период платформы, то в этом случае, занимая половину R, требуемая концентрация L(ЭК50)Значение KD.
Концентрация насыщения в основном измеряет значения сигнала, представляющие комплекс RL, который может быть измерен проточной цитологией, изотопной меткой, флуоресцентной поляризацией или ELISA.

Общие методы разработки методологии ELISA для определения сродства

Раскладка

Общий рабочий процесс

01Подготовка ферментной пластины: взятие антигена с концентрацией 100 мкг / мл, растворение при комнатной температуре, смешивание с раствором в пакете разбавлено до 0,2 мкг / мл, 0,5 мкг / мл, 1 мкг / мл, добавление 100 мл / отверстие в соответствии с таблицей компоновки образца, соответственно, в ферментную пластину(Примечание 1)В том числе добавьте упаковку жидкостью, чтобы сделать упаковку для контроля антител, 2 - 8°C на ночь;
02Промыть пластину моющим раствором 3 раза, высушить, добавить 300ul / отверстие закрытой жидкости(Примечание 2)Закрытие комнатной температуры на 1 час; Моющее средство для стирки пластины 3 раза, высушено для использования;
03Разбавить антитела по макету при 3 - кратном градиенте, начиная с 100000нг / мл.(Примечание 3)В соответствии с макетом, 100ul / отверстие добавляется в микропористую пластину;
04Введитегенератор на микропористой пластине Орхауса (ISLDMPHDG)Внутри, установите колебания 37°C, 600 rpm в течение 1 часа;

05Промыть доску моющим раствором 3 раза, высушить;
06Ферментные антитела разбавлены до нужной концентрации.(Примечание 4)Ввихревой прибор Орхауса(VXMNFS)вверхСмешивание, 100ul / отверстие;

07Поместите в генератор микропористой пластины, установите колебания 37°C, 600 rpm в течение 1 часа;
08Промыть доску моющим раствором 4 раза, высушить;
09Возьмите ферментативные антитела, соответствующие проявительной жидкости, в течение первых 20 минут, чтобы сбалансировать до комнатной температуры, смешать на вихревом смесителе;
10Добавление цветной жидкости в 100 л / отверстий с использованием 8 - ствольного оружия;
11Цветовая жидкость при комнатной температуре, чтобы избежать света в течение 10 - 30 минут(Примечание 5)*
12Восемь выстрелов с использованием 100 л / отверстий, чтобы положить конец реакции(В зависимости от субстрата, этот шаг может не понадобиться)*
13Измерение сигнала с помощью энзимометра(Примечание 6)* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
14Анализ результатов(Примечание 7)А.

Маленький Note

Примечание 1:Если необходимо уменьшить концентрацию антител во время реакции(100000 нг/мл)Неспецифическая адсорбция ферментных пластин, в процессе упаковки рекомендуется выбрать гидрофобные ферментные пластины(Полиэфирное волокно)Концентрация антигена в пакете требует небольшого количества 0,2 - 1ug / мл, и обстоятельства должны быть оптимизированы в зависимости от размера сродства антигена. Как правило, чем сильнее сродство, тем ниже концентрация необходимого антигенного пакета.
Примечание 2:Закрытый раствор не обязательно должен быть закрытым, его нужно проверить экспериментально.(Не включено в группу антигенов)Как правило, чем меньше молекулярная масса, тем лучше эффект уплотнителя.
Примечание 3:На начальном этапе разработки методологии диапазон концентрации стандартной кривой может быть увеличен до 100 000 нг / мл - 0,1 нг / мл, чтобы получить полную кривую с явным периодом верхней и нижней платформ, градиентная концентрация может быть уменьшена, а кратное разбавление может быть уменьшено до 2 раз в процессе методологической оптимизации.
Примечание 4:Эффект ферментативного антитела является избыточным, разбавление ферментативного антитела требует различных степеней разбавления для сравнительного отбора, для моноанти - ингредиентов ферментативного антитела, если два уровня разбавления ферментативного антитела могут генерировать одну и ту же кривую дозы, что указывает на избыток ферментативного антитела, передача сигнала ELISA не имеет отклонений.
Для полиантигенных ферментативных антител определение степени разбавления является более сложным, и концентрация моля ферментативного антитела может быть первоначально рассчитана более чем в пять раз выше, чем концентрация антигена моля на упаковке. Когда концентрация ферментативно - ассоциированных антител выше, ферментативно - ассоциированные антитела пойманы в высоких дозах различных концентраций антител, кривая имеет ложную платформу.
Примечание 5:Для субстратов с значениями поглощения и флуоресцентных субстратов значение сигнала, обнаруженного прибором, пропорционально времени проявления цвета, желательно контролировать в течение 10 - 30 минут. Необходимо заранее подтвердить линейный диапазон сигнала контрольно - измерительного прибора, например, линейный диапазон сигнала для значений поглощения ферментативного маркера составляет 0 - 3, значение поглощения нелинейно между 3 - 4, значение сигнала должно контролироваться не более 3 при ярком цвете, а кривая имеет ложную платформу, когда значение сигнала превышает линейный диапазон.
Примечание 6:Различные субстраты должны быть обнаружены с помощью различных приборов, значения чтения поглощения, значения чтения флуоресценции, значения чтения химической люминесцентности. При выборе субстрата обратите внимание, обладает ли лабораторный энзимометр этим типом функции считывания.
Примечание 7:Стандартная кривая дозы, как правило, соответствует четырем параметрам, требующим очевидного периода вверх и вниз по платформе(Значение A, D)Наклон обычно составляет 0,8 - 1,2(Значение B)Между ними, EC50（Значение C)Значение сродства антител по отношению к антигенам.

V. РЕЗЮМЕ

В соответствии с методом концентрации насыщения для определения сродства с помощью ELISA требуется четкая кривая S - типа с четырьмя параметрами, т.е. кривая сигнала, которая постепенно изменяется с концентрацией антител.
При низкой и высокой концентрации антитела наблюдается выраженная верхняя и нижняя стадия платформы, половина значения сигнала верхней плоскости соответствует концентрации антитела(ЭК50)Значение KD является значением межантигенной близости антител.
Поскольку линейный диапазон сигналов обнаружения прибора ограничен, когда сигнал превышает линейный диапазон, кривая переходит в период ложной платформы, что делает измеренные сродства неточными.
Концентрация антигена в пакете напрямую определяет значение сигнала,Поэтому при измерении сродства с помощью ELISA концентрация антигена в пакете должна быть минимальной, чтобы получить соответствующее значение сигнала; Низкие концентрации ферментативных антител также могут привести кривую к фазе ложной платформы.

При разработке методологии ELISA для линейной передачи сигнала от избытка ферментативных антител требуется экспериментальная проверка.
Когда сигнал не может получить эффективную фазу выхода на платформу, это указывает на то, что антигенные антитела слишком слабы или слишком сильно упакованы антигенами, и требуется большая концентрация антител, чтобы все антигены были пойманы, чтобы достичь фазы платформы.
Ограничение чувствительности ELISA, в некоторых случаях более слабое сродство(>100 нМ)В антигенах антител применение метода ELISA в основном не дает эффективного периода платформы и не может измерить значения сродства.
Когда ELISA проводит аффинометрию, чтобы оценить активность антигена или определить активность антитела, получаемый EC50 не меньше, чем лучше, и сигнал переходит в фазу ложной платформы(Достижение предела обнаружения прибора, концентрация ферментативной связи меньше)Все они уменьшают EC50, что приводит к получению неправильных данных о сродстве, которые также легко возникают, когда ELISA проводит измерения сродства.
В настоящее время многие поставщики антигенных белков имеют такие ошибки в оценке антигенной активности.

Сопротивление между антигенами и антителами определяется их структурой и взаимодействием,Это может быть 0,1 нм, 1 нм или 1000 нм. Оценка эффективности метода ELISA зависит от того, соответствует ли это значение EC50 значению сродства, которое может быть проверено с помощью многогранных измерений, таких как термодинамическое, динамическое и клеточное измерение концентрации насыщения.
И наоборот, когда метод ELISA не существует, например, когда сигнал переходит на фальшивую платформу,(Достижение предела обнаружения прибора, концентрация ферментативной связи меньше)При ошибке значение EC50 является истинным значением, отражающим сродство.

Методологическая разработка с использованием ELISA требует четкого применения целей, количественных и аффинитных измерений макромолекул.
Относительная концентрация дозы антигена и антитела для разных целей применения будет сильно различаться, с различными кривыми дозы,Читатели могут провести сравнительное исследование в сочетании с предыдущей статьей « Практическая версия разработки методологии ELISA - разработка количественных методов обнаружения биологических макромолекул», чтобы прояснить различия.

Поделиться этим делом можно здесь, увидимся в следующем номере!

Предыдущие статьи

Орхаус помогает локализовать вакцину против ВПЧ
Правда о генетическом коде - расшифровка CRISPR
На что обращают внимание те, кто хочет купить лабораторные кровати?
Проверьте это. Ваши лабораторные приборы снова забастовали?
Биомедицинские исследователи * Методы разработки ELISA
Страшнее, чем лейкемия - шистосомоз.
Применение кровати Орхаус при обработке крови

Хотите узнать о высококачественных продуктах Ohaus? Пожалуйста, свяжитесь с нами и оставьте свою информацию, и наши профессиональные инженеры будут служить вам!
Чтобы прочитать больше интересных статей, добро пожаловатьОфициальный аккаунт WeChatОрхаус, СШАЭй!