Снова школьный сезон.Экспериментальный ВанСнова "кирпичики".
какЮйЯркий кирпичещёНе надо.Брат и сестра.

Конечно.следить« Маленький австрийский класс»КолонкаДа.

Сегодня мы представляем вам малышей.
Это статья.Полный груз.的
Практическое руководство по методам демонстрации фагов
"Амплификация и количественная оценка фагов"

Это редкая заметка.
Пожалуйста, уберите (коллекция)!

Часть 1

Гибридная опухоль、Одноклеточное клонированиеиФаговые технологииЭто три основных метода обнаружения антител,Фаговые технологиикакТехнология Нобелевской премии.Он играет важную роль в разработке биоинновационной медицины,* Ускорение процесса разработки препаратов типа антител.Фаговые технологииОн не только играет центральную роль в обнаружении и оптимизации новых антител и полипептидов, но и в сочетании с традиционными методами иммунизации животных для эффективной стыковки с наноантителами и платформами обнаружения генетически модифицированных мышей с человеческим происхождением,Может широко использоваться в таких областях, как антитела, антитела - связывающие препараты и CAR - T / TCR - TА.В этой статье будут обсуждаться детали экспериментов по размножению и амплификации фагов в технологии фагового дисплея, делиться опытом конкретных экспериментальных процессов, руководствоваться их принципами в качестве основы для руководства экспериментальным процессом, совершенствовать экспериментальный процесс и увеличивать успех фагового дисплея в процессе обнаружения антител.

Часть 2

- Библиотека фагов.
Основные принципы расширения и демонстрации.

В настоящее время широко используемый фаг показывает фрагменты антител"Система 3 + 3"(3 белка оболочки p3 для бактериофагов)*3 + 3Существует два источника белка оболочки p3:

• Фагофаг (phagemid)
• M13KO7 - Вспомогательный фаг (Helper Phage)

Грибы(phagemid) белки p3, которые объединяют гены фрагментов антител, являются ключом к разнообразию библиотеки;Вспомогательный фагБелки p3 на Helper Phage являются естественными белками p3 для бактериофагов.
* Фагофаг является относительно небольшим переносчиком плазмиды, который обладает высокой эффективностью преобразования в сенсорном состоянии кишечной палочки и может расширяться в кишечной палочке.

После заражения вспомогательным фагом (Helper Phage) кишечная палочка, содержащая бактериофаги, расширяется с помощью ферментативной системы, сырья и энергии кишечной палочки, и фаг, содержащий бактериофаги, в конечном итоге выделяется из кишечной палочки, а белки оболочки p3 этого дочернего фага демонстрируют фрагменты антител.

Часть 3

Во время расширения фагов
Проблемы и соответствующие решения.

Процесс создания фага на самом деле является процессом передачи генетического разнообразия фрагментов антител:
Процесс передачи от разнообразия генов антител в образцах крови к фагофагам является частью построения библиотеки фагоцитов;
От фагофобного разнообразия до разнообразия кишечной палочки, содержащей фагофобные гранулы, это содержание фагофобной плазмиды, преобразующей кишечную палочку;
Передача разнообразия бактерий кишечной палочки, содержащих бактериофаги, фагам является частью расширения фагов и предметом экспериментального опыта в этой статье.

Амплификация фага в конечном итоге направлена на то, чтобы превратить одну копию фрагмента антитела в фаг в 10 - 100 копий в процессе амплификации фага,И эти копии генов могут показывать фрагменты белка антитела на белке p3 на поверхности фага.

Для сохранения и передачи разнообразия библиотеки в процессе амплификации фагов необходимо рассчитать и оценить количество и объем бактерий кишечной палочки, содержащих бактериофаги в процессе амплификации, количество активных инфекций, связанных с количеством добавочных бактериофагов, и количество бактериофагов, содержащих бактериофаги, очищенных после амплификации, в зависимости от первоначального размера библиотеки,Фаговые библиотеки разных размеров требуют разных объемов расширения в процессе расширения.Экспериментальная программа отверждения, вероятно, приведет к потере разнообразия библиотеки.
Чтобы разобраться в этих проблемах, сначала необходимо иметь предварительные знания, основанные на следующих моментах:

( 👇 Следующий Все в центре внимания!! )

1. Показания TG1 Coli Bacillus в OD600: 1OD представляет собой концентрацию 1e9 / мл.
2. Бактериофаги / адъювантные фаги имеют лучшую инфекционную эффективность, когда TG1 находится в логарифмическом *, а TG1 имеет значение OD600 в логарифмическом * 0,4 - 0,8.
3. Скорость роста TG1 в логарифмическом * поколении составляет 20 минут, что требует пристального внимания к росту TG1 и своевременного взятия бактерий для экспериментов.4. Соотношение между вспомогательным фагом и TG1 MOI гарантирует, что все TG1 будут инфицированы в 20: 1.
5. Фаги, содержащие бактериофаги, могут инфицировать обычную кишечную палочку TG1 и оставлять бактериофаги в TG1 и расширяться по мере расширения TG1 без расширения фагов.
6.Фаговые гранулы содержат * устойчивость, а вспомогательные фаги содержат * устойчивость.
7. Фаги, содержащие бактериофаги, могут быть измерены титрами путем заражения нормальной TG1, градиентно - разбавленной * резистентной пластиной агара.8.Фаги, содержащие бактериофаги в режиме 3 + 3, показали относительно низкую эффективность P3 - конвергентных фрагментарных белков антител, всего 5 - 10%, и при отборе добавочный фаг должен быть более чем в 100 раз более разнообразным, чем библиотека.
Еще один важный вопрос:Бактериофаги, как вирус, легко распространяются в воздухе в виде аэрозолей, загрязняющих лабораторную среду, тем самым заражая F - положительную кишечную палочку.(Боль за био Ван, рискуя жизнью, чтобы переместить кирпич!)
вФаги показывают соответствующие экспериментыИх необходимо проводить в относительно закрытых лабораториях.Чтобы избежать заражения бактериофагов кишечной палочкой,Особенно при культивировании нормальной кишечной палочки TG1. Фаг обычно инактивируется ультрафиолетовым облучением более получаса.
(Квалифицированный биологический Ван, вирусный убийца чувств Мода!)

Часть 4

- Фаговое расширение.Увеличение и количественная оценка
Поделиться конкретными экспериментальными процессами.

Ниже приводится экспериментальная схема расширения библиотеки фагов размером с 1E9.
* Если библиотека слишком большая или слишком мала, то объем пополнения может увеличиваться или уменьшаться пропорционально.

День 1
(Один день с облысением кирпича)

1. Возьмите 1 мл штамма TG1, содержащего бактериофаги (количество бактерий 1E10), и добавьте 250 мл в бутылку, содержащую 100 мл 2xYT - GA питательной среды,использоватьстол Орхауса37 градусов 220rpm качающийся стол до OD600 около 0,5А.2. Возьмите 20 мл бактериальной жидкости OD600 около 0,5 (количество бактерий 1E10) и добавьте вспомогательный фаг M13 K07 с pfu 2E11 в соответствии с MOI 20: 1, 37 градусов 220rpm колебания в течение получаса для инфекции.3. Взять бактериальную жидкость после заражения в 50 мл центрифуг.Центрифуга Орхауса 5816R3200 г - 10 минут.Удалите питательную среду, чтобы удалить глюкозу из среды для подавления экспрессии белка p3 в фагофаге, который объединяет фрагменты антител.4. С помощью 2 - xYT - AK питательной среды тяжелая суспензия, питательная среда плюс 400 мл, с 1 - литровой бутылкой при 30 градусах 220rpm ночная встряхивание бактерий.

День 2
(На следующий день облысел кирпичом)

5.Разделите 400 мл бактериальной жидкости в большие центробежные бутылки,использоватьЦентрифуга Орхауса 5816R 10000 г - 10 минут.Взять чистку, 10000g снова центрифугировать в течение 10 минут,Удаление остатков бактерий.6. Возьмите 90 мл раствора PEG и добавьте 400 мл очищающей жидкости, вылупите 1 час при 4°C и сопровождайте мягкие колебания, а затемИспользуйте функцию низкотемпературного контроля.Центрифуга Орхауса 5816R 4°C 10000g центрифуга 1 часА.7. Чтобы очиститься, добавьте 2,5 мл раствора PEG для повторного осаждения после повторного взвешивания фага 10 мл PBS.8. Лежать на льду 20 минут, а потом...Используйте функцию низкотемпературного контроля.Центрифуга Орхауса 5816R4°C 10000g центрифуга полчасаА.9. Чтобы очистить жидкость, высушите остаточный раствор ПЭГ всасывающей бумагой и добавьте 1 - 2 мл тяжелых суспензионных фагов PBS для измерения капель.

Измерение титра:
1. В разделенных лабораториях берут обычную кишечную палочку TG1 и добавляют в питательную среду 2xYT,использоватьстол ОрхаусаЗначение колеблющихся бактерий до OD600 составляет 0,5.Если он не используется вовремя, его можно поместить в резерв при температуре 4°C 2 часа.
2.Разбавьте протоплазму амплифицированного фага на этапе 9 в 1 E5 - E7 раз с помощью PBS.
3. Возьмите 10 - ul - фаговый разбавленный раствор и добавьте 490ul OD600 в кишечную палочку TG1 0,5,использоватьстол Орхауса 37°C 220rpm колеблется полчасаПровести инфекцию.
4. Взятие инфекционного раствора 50ul равномерно наносится на лист агара, содержащий 2xYT - GA, высушивается и помещается в инкубатор 37°C на ночь. В качестве отрицательного контраста нанесите лист агара неинфицированной кишечной палочкой TG1.

День 3
(Третий день облысения кирпича)

5. Количество клонов в агаровой пластине 2xYT - GA, титр амплифицированного фага рассчитывается на основе кратного разбавления
Фаговое титрование (pfu / ml) = (клонированное число * 10 * 50 / 10ul) * кратное разбавлению
6.Фаги 1E11 - 1E12 берутся для экстракции.

Рецепт реагента:
Среда 2xYT:Экстракт дрожжей 10,0 г/л + триптон 16,0 г/л + NaCl 5,0 г/л
Среда 2xYT - GA:Культивная среда 2xYT + 100 мкг / мл * + 1% (W / V) глюкоза
Среда 2xYT - AK:Культивная среда 2xYT + 100 мкг / мл * + 50 мкг / мл *
PEG溶液：20% (в/в) ПЭГ 6000, 2,5 М NaCl

Часть 5
Прибор *:

(Каждый день в качестве научного работника - мигранта не одинок, потому что в сопровождении маленькой олимпиады)

Бактериофаги, как вирус, могут легко распространяться в виде аэрозолей, загрязняющих окружающую среду в лаборатории, требуя закрытых лабораторий, и все лабораторные приборы должны использоваться отдельно.
Орхаустермостатический питательный стол с лёгкой нагрузкойДиапазон оборотов 100 - 12 - rpm, интенсивный по объему и мощный, обеспечивает отличный эффект качания для вашего образца:

Кроме того, во время эксперимента фагов будут различные объемы, разные скорости вращения и центробежные шаги, требующие условий 4°C, еслипомного
Настольная центрифугаУдовлетворение потребностей экспериментаЭто приведет к пустоте активов экспериментального оборудования, что приведет к * отходам!Эй!Эй!

Орхаус5816R Многофункциональная центрифугаИ дополнительные роторы облегчают эксперименты, связанные с фагами, и одна центрифуга удовлетворяет все экспериментальные потребности!

Далее, Маленький Оо взял тебя с собой.
"Помочь вам сэкономить на научных исследованиях", эта машина
Научите правильно чистить шерсть Орхауса.

Германия*
Мощный, центробежный эффект.
Орхаус Фронтьер ™ Семейство центрифуг.
Выпуск« Купить подарок»* Деятельность

* Модели следующие
Высокоскоростная центрифугаФК5515Р(Замороженная модель)
Высокоскоростная центрифугаФК5515(Замороженные модели)
Новые компактные микроцентрифуги.ФК5513
Теперь садись в машину, еще успеешь!

Подробности, пожалуйста, ткните гнилой плакат, пожалуйста, очистите QR - код. 👇

Хотите узнать больше оПродукция лаборатории ОрхаусИнформация? Входите.Читать полностьюОставьте информацию, наши профессиональные инженеры приедут быстро, к вашим услугам!
А